Etude de la modulation de la virulence de Pseudomonas aeruginosa par Candida albicans dans un modèle de pneumonie

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Etude de la modulation de la virulence de Pseudomonas aeruginosa par Candida albicans dans un modèle de pneumonie Jean-Baptiste Méar To cite this version: Jean-Baptiste Méar. Etude de la modulation de la virulence de Pseudomonas aeruginosa par Candida albicans dans un modèle de pneumonie. Médecine humaine et pathologie. Université du Droit et de la Santé - Lille II, Français. NNT : 2014LIL2S013 . tel HAL Id: tel https://tel.archives-ouvertes.fr/tel Submitted on 20 Nov 2014 HAL is a multi-disciplinary open access archive for the deposit and dissemination of scientific research documents, whether they are published or not. The documents may come from teaching and research institutions in France or abroad, or from public or private research centers. L archive ouverte pluridisciplinaire HAL, est destinée au dépôt et à la diffusion de documents scientifiques de niveau recherche, publiés ou non, émanant des établissements d enseignement et de recherche français ou étrangers, des laboratoires publics ou privés. UNIVERSITE LILLE NORD DE FRANCE ECOLE DOCTORALE BIOLOGIE SANTÉ DE LILLE THÈSE D UNIVERSITÉ Discipline : Maladies infectieuses Présentée publiquement par Jean-Baptiste MÉAR Le 03 Février 2014 Étude de la modulation de la virulence de Pseudomonas aeruginosa par Candida albicans dans un modèle de pneumonie Membres du Jury Président: Rapporteurs: Examinateur: Directeurs de thèse: Pr Françoise VAN BAMBEKE Pr Muriel CORNET Pr Bertrand TOUSSAINT Dr Philippe GOSSET Pr Benoit GUERY Dr Eric KIPNIS - REMERCIEMENTS - Je remercie le Pr Benoît Guery, dit le méchant de m avoir accepté dans son équipe et de m avoir fait confiance. Merci pour toutes les opportunités que tu m as données et qui m ont permis de rencontrer plein de gens formidables et de voyager dans le monde entier! Merci pour ton encadrement libre, qui permet de garder le cap sans fermer les portes au découvertes faites en passant. Je remercie le Pr Karine Faure de m avoir convaincu de faire la thèse pour continuer à m amuser, pour ses remarques pertinentes, son soutien inconditionnel dans les situations difficiles et sa diplomatie! Je remercie le Dr Eric Kipnis pour avoir co-encadré ma thèse avec Benoît. Merci pour toutes les séances de travail pour les dead line de dernière minute, les idées lancées comme ça toujours pertinentes et le soutien moral les jours de blues. Merci d avoir été le meilleur chasseur de resto des 3 dernières années, et de nous avoir toujours déniché la petite gargote qui va bien où que tu sois! Merci à vous trois de m avoir montré qu on pouvait être PU-PH et être humain, être doué sans se la raconter et que la médecine n empêchait pas de faire du surf ou de la guitare électrique! Merci au Pr Renaud Verdon de m avoir orienté vers l équipe de Benoît, pour m avoir fait confiance, m avoir soutenu et épaulé pendant ces 3 années. Merci au Dr Philippe Gosset de m avoir encadré pour toutes les manips concernant la cytométrie en flux. Merci pour votre rigueur scientifique, votre disponibilité et votre générosité. Merci pour votre phlegme Anglais légendaire et pour le vélo qui m a permis de rester fidèle à ma réputation pendant les six derniers mois de thèse. Merci au Dr Hélène Tiesset, pour avoir été mon initiatrice à la recherche et m avoir appris à maniper, des souris à la bactério. Merci de nous avoir, Cécile et moi, accueilli dans le labo et encadrés tout au long de notre master II! Merci au Dr Cécile Rouyer, ma co-interne de Master II de Marseille à Lille, aux côtés de qui j ai découvert la vie de labo, l entraide, la satisfaction des expériences réussies et le désespoir des manips qui ratent! Merci au Dr Rodrigue Dessein pour sa bonne humeur, sa verve flamboyante et pour son sac rose. Merci aussi pour les idées à foison et les manips de qpcr qui ont -enfin- été reproductibles! Merci au Dr Fanny Vuotto : c est grâce à toi et à ta présentation au G4 que je me suis embarqué dans cette aventure. Merci pour ta bonne humeur et tes critiques constructives. Merci au Dr Anne Prevotat pour ses conseils avisés, pour m avoir remonté le moral quand j ai débarqué dans le grand Nord depuis Marseille. Merci pour ton amitié cash et pour avoir couvert tous les menus larcins organisés dans le service! Merci à Emmanuel Faure (Dr Faure maintenant!) et au Dr Guillaume Schurtz, les meilleurs co-thésard ever. Merci pour tous les moments partagés au cours de cette thèse : pour le fricadellome, les manips improvisées, les nuits passées devant le cytomètre ou lorsque la neige m empêchait de retourner sur Paris Merci de m avoir initié à la culture ch ti, aux bières belges, aux manips à trois et aux bière sur le toit! Le fait de vous avoir rencontré justifie cette thèse en soi!! Merci au Dr Muriel Pichavant, à Gaëlle Rémy, à Gwenola Kervoazé et à Eva Vilain pour leur soutien, leur bonne humeur et leur aide précieuse! Merci à Teddy Grandjean pour m avoir appris la qpcr, aux Dr Sylvain Normand et Aurélie Couturier, à Marion Thépaut, Anne Delanoy et Myriam Delacre pour leur bonne humeur et pour le front uni formé dans les moments difficiles. Merci aux membres de l équipe 2 de l U995, et plus particulièrement au Pr Daniel Poulain, l un des instigateurs de mon projet, et au Dr Chantal Fradin pour leur aide et leurs conseils avisés. Merci aux membres de l équipe 8 du CIIL. Merci plus particulièrement à Josette Fontaine, Julien Tabareau et au Dr Christophe Carnoy pour leur bienveillance. Merci à Thierry Chassat pour avoir été toujours arrangeant et de m avoir permis de faire mes manips de thèse dans de bonnes conditions. Merci à Julien Buyck, dit le belge et à toute l équipe de Louvain (Ahalieyah, Eugénie) pour leur bonne humeur et les échanges d idées (et de souches). Merci au Dr Maya Kroubi pour avoir égayé les repas pris au labo pendant le Master II! Merci à Fabienne Meslem, pour m avoir fait découvrir et aimer Marseille et m avoir initié à la cuisine Algérienne pendant 6 semaines! Merci à l équipe d hémato du CHU de Caen d avoir été compréhensive lorsque je suis revenu, après 3 ans sans toucher un patient! A Sylvain, Anne-Claire, Marie, Quentin, Christophe et Charles pour avoir rendu agréable le retour sur Caen. Merci également à toutes les personnes que j ai rencontrées et qui m ont aidées à différents niveaux : les Dr Chanez Chemani, Henry Bernard, et tous les membres du GDR. Merci à mes parents pour m avoir non seulement laissé faire ce que je voulais, mais pour m avoir en plus soutenu au cours de toutes ces années! Merci à Cécile d avoir partagé cette aventure avec moi, entre le collège de France, Créteil, la gare du Nord et Lille. Merci aussi pour ton soutien, pour le meilleur et pour le pire! Merci aux Professeurs Françoise Van Bambeke, Muriel Cornet et Bertrand Toussaint pour leur soutien et leurs conseils tout au long de la thèse, et pour avoir accepté de venir juger ce travail. Ce travail a été réalisé sous la codirection du Professeur Benoit Guery et du Docteur Eric Kipnis, au sein du Host-pathogen translational research group, Faculté de Médecine de Lille UDSL, en collaboration avec le Dr Philippe Gosset, Institut Pasteur de Lille, Centre d Infection et d Immunité de Lille, Université Lille Nord de France, Inserm U1019 CNRS UMR 8204, Lille, et avec le Pr Daniel Poulain, Regulation of candida cell wall glycan-host interface, Faculté de Médecine de Lille, Université Lille Nord de France, CHRU de Lille, Inserm U995, Lille. Ce travail a donné lieu aux communications & publications suivantes : Communications affichées : MEAR JB., KIPNIS E., TIESSET H, JAWAHARA S, ROUYER C, VUOTTO F, POULAIN D, CHAMAILLARD M, FAURE K, GUERY BP. Lung sensitization by Candida albicans protects from Pseudomonas aeruginosa-induced lung injury independently of Quorum Sensing. ICMI, Mai 2011, Paris. MEAR JB., KIPNIS E., TIESSET H, JAWAHARA S, ROUYER C, VUOTTO F, POULAIN D, FAURE K, GUERY BP. Role of Candida albicans and Pseudomonas aeruginosa direct interaction in the protective effect of C. albicans colonisation on P. aeruginosa-induced lung injury. ECCMID, Avril 2011, Milan. MEAR JB., FAURE E., KIPNIS E., GOSSET P., SCHURTZ G., FAURE K, GUERY BP. Lung sensitization by Candida albicans protects from Pseudomonas aeruginosa-induced lung injury. ICAAC, Septembre 2012, San Francisco. Communications orales : MEAR JB., KIPNIS E., TIESSET H, JAWAHARA S, ROUYER C, VUOTTO F, POULAIN D, FAURE K, GUERY BP. Etude de la modulation de la virulence de Pseudomonas aeruginosa par Candida albicans dans un modèle de pneumonie. Rencontres Junior/Senior Myco, Annecy, Décembre MEAR JB., KIPNIS E., TIESSET H, ROUYER C, POULAIN D, CHAMAILLARD M. FAURE K, GUERY BP, GOSSET P. Lung sensitization by Candida albicans protects from Pseudomonas aeruginosa-induced lung injury through macrophage activation not polymorphonuclear recruitment. Inflammation, Paris, Juin 2011. MEAR JB., FAURE E. KIPNIS E., FAURE K., DESSEIN R., SCHURTZ G., GOSSET P., GUERY BP. Lung sensitization by Candida albicans protects from Pseudomonas aeruginosa-induced lung injury Through Expression of Antimicrobial Peptides. J2R, Lille, Octobre 2012 MEAR JB., FAURE E. KIPNIS E., FAURE K, DESSEIN R., SCHURTZ G., GOSSET P., GUERY BP. Etude de la modulation de la virulence de Pseudomonas aeruginosa par Candida albicans dans un modèle de pneumonie. GDR Pseudomonas, Autrans, Octobre 2011 Publications MEAR JB., KIPNIS E., FAURE E., DESSEIN R., SCHURTZ G., FAURE K., GUERY BP. Candida albicans and Pseudomonas aeruginosa Interactions: More Than an Opportunistic Criminal Association? Med Mal Infect Apr;43(4): doi: /j.medmal Epub 2013 Apr 23. MEAR JB., GOSSET P., KIPNIS E., FAURE E., DESSEIN R., JAWHARA S., FRADIN C., FAURE K., POULAIN D., SENDID B., GUERY BP. Candida albicans airway exposure primes the lung innate immune response against Pseudomonas aeruginosa infection through innate lymphoid cell recruitment and IL-22 associated mucosal response. Infect Immun Jan;82(1): doi: /IAI Epub 2013 Oct 28 FAURE E., MEAR JB., FAURE K., NORMAND S., COUTURIER-MAILLARD A., GRANDJEAN T., BALLOY V., DESSEIN R., CHIGNARD M., UYTTNEHOVE C., GUERY BP., GOSSET P., CHAMAILLARD M., KIPNIS E. Pseudomonas aeruginosa Type-3 secretion system dampens host defense by exploiting NLRC4 inflammasome. American Journal of respiratory and critical care medicine (2014). BOUKERB A., ROUSSET A., GALANOS N., MEAR JB., GILLON E., CECIONI S., ABDERRAHMEN C., FAURE K., REDELBERGER D., KIPNIS E., DESSEIN R., HAVET S., DARBLADE B., MATTHEWS S., DE BENTZMANN S., GUERY BP., COURNOYER B., IMBERTY A., VIDAL S. Anti-adhesive properties of glycoclusters against Pseudomonas aeruginosa lung infection Journal of Medicinal Chemistry (Soumis en 2014) Travaux réalisés en collaboration au cours du travail de thèse Test d un inhibiteur glycosidique (GMI-1051) des lectines de P. aeruginosa dans un modèle murin d infection pulmonaire chronique. Dr J. Magnani, Glycomimetics Inc., GAITHERSBURG, MD, USA Protection de la pneumonie à P. aeruginosa par une souche vaccinale de Bordetella pertussis (Bpze1). Dr C. Locht, CIIL, Inserm U1019, Institut Pasteur de Lille, LILLE. Test de souches de P. aeruginosa mutées pour les gènes impliqués dans le métabolisme des Kynurénines dans un modèle murin de pneumonie. Pr B. Toussaint, Laboratoire The Rex/TIMC-IMAG, CNRS UMR 5525, GRENOBLE. Test de l effet de la forskolin, du Salmeterol et du rolipram (inhibiteurs de dégradation de l AMPc) dans un modèle murin de pneumonie à P. aeruginosa. Dr P. Huber, UMR1036 INSERM-CEA-UJF / CNRS ERL5261, CEA, GRENOBLE. Test d inhibiteurs glycosidique (Kalyxarènes) des lectines de P. aeruginosa dans un modèle de culture cellulaire. Dr S. Vidal, Laboratoire de Chimie Organique 2 - Glycochimie UMR- CNRS 5246, Université Claude Bernard Lyon 1, LYON. Test de l effet d extraits d huiles essentielles dans un modèle murin de pneumonie à P. aeruginosa. M me E. Rossines, Aromatechnologies SAS, ROMORANTIN-LANTHENAY. - SOMMAIRE - INTRODUCTION I. LA PNEUMONIE I. A. Définition, symptomatologie, épidémiologie I. B. Physiopathologie I. C. Modèles animaux de pneumonie I. C. 1. Infection des animaux I. C. 2. Modèle chronique I. C. 3. Modèles de PAVM I. C. 4. La lésion pulmonaire I. C. 5. Choix du modèle II. CANDIDA ALBICANS II. A. Caractéristiques microbiologiques II. A. 1. Classification II. A. 2. Morphologie II. A. 3. Paroi II. A. 4. Quorum Sensing II. A. 5. Biofilm II. B. Distribution, habitat II. C. Virulence II. D. Pathogénicité II. D. 1. Candidoses muqueuses II. D. 2. Candidoses invasives II. E. Facteurs favorisants & Réponse de l hôte II. E. 1. Mécanismes déduits de pathologies humaines II. E. 1. α. Candidoses muqueuses II. E. 1 β. Candidoses invasives II. E. 2. Modèle intégré de la réponse à C. albicans III. PSEUDOMONAS AERUGINOSA III. A. Caractéristiques microbiologiques III. B. Distribution, habitat III. C. Virulence III. C. 1. Quorum Sensing III. C. 2. Facteurs de Virulence III. C. 2. α. Facteurs sécrétés III. C. 2. β. Facteurs constitutionnels III. D. Pathogénicité, facteurs favorisants III. E. Réponse de l hôte IV. INTERACTIONS ENTRE C. ALBICANS & P. AERUGINOSA MATÉRIEL & MÉTHODES I. MODÈLE ANIMAL I. A. Animaux I. B. Souches de bactérie et de levure I. B. 1. Pseudomonas aeruginosa I. B. 2. Candida albicans I. B. 3. Autres microorganismes I. C. Modèle murin de pneumonie I. C. 1. Colonisation & infection I. C. 2. Traitements pharmacologiques (cf. Tableau 2)... 45 I. C. 3. Transfert de cellules immunitaires II. ÉVALUATION & RECUEIL DE RÉSULTATS DANS LE MODÈLE ANIMAL II. A. Poids & survie II. B. Quantification des lésions pulmonaires : perméabilité de la barrière alvéolocapillaire II. C. Analyse bactérienne et fongique II. C. 1. Charges bactérienne et fongique pulmonaires II. C. 2. Translocation bactérienne et fongique II. D. Caractérisation de la réponse immune II. D. 1. Caractérisation cellulaire II. D. 1. α. LBA et récupération des poumons II. D. 1. β. Extraction des cellules II. D. 1. γ. Analyse des cellules par cytométrie en flux II. D. 2. Dosage des cytokines dans le surnageant de LBA II. D. 3. Dosage des défensines par RT-qPCR III. IN VITRO III. A. Extraction des composants de la paroi de C. albicans III. A. 1. Extraction des mannanes III. A. 2. Extraction des β-glucanes III. A. 3. Extraction de la chitine III. B. Stimulation cellulaire in vitro IV. ANALYSES STATISTIQUES RÉSULTATS I. VALIDATION DU MODÈLE DANS LE FOND C57BL/ II. VOIES DE SIGNALISATION IMPLIQUÉES DANS LA RÉPONSE PROTECTRICE III. RÉPONSE CELLULAIRE ET CYTOKINIQUE INDUITE PAR C. ALBICANS IV. CCL V. UTILISATION DES POLYOSIDES PARIÉTAUX DE C. ALBICANS DISCUSSION CONCLUSION BIBLIOGRAPHIE... 70 - FIGURES & TABLEAUX - Figure 1. Physiopathologie des lésions de la barrière alvéolocapillaire Figure 2. Arbre phylogénétique de C. albicans Figure 3 : Morphologies de C. albicans Figure 4 : Structure de la paroi de C. albicans Figure 5 : Molécules du QS de C. albicans Figure 6. Filamentation: passage de la colonisation à l infection Figure 7 : Modèle simplifié de la réponse induite par C. albicans au niveau pulmonaire Figure 8. Arbre Phylogénétique de P. aeruginosa Figure 9. Biofilm de P. aeruginosa Figure 10 : Quorum Sensing de P. aeruginosa Figure 11. Facteurs de virulence de P. aeruginosa Figure 12. Groupes expérimentaux Figure 13. Evaluation du modèle dans les fonds génétiques BALB/c et C57BL/ Figure 14 : Evaluation des voies de l IL-1β et NFκB Figure 15. Rôle de CCL20 dans le recrutement des ILC Figure 16 : Evaluation de l activité des polyosides pariétaux de C. albicans dans la protection au cours des pneumonies Figure 17 : Modèle de la réponse induite par C. albicans Figure 18: Modèle de la réponse induite par P. aeruginosa après exposition à C. albicans Tableau 1. Facteurs favorisants des candidoses Tableau 2. Traitements administrés aux différents groupes de souris Tableau 3. Mix d anticorps en fonction des cellules d intérêt Tableau 4. Amorces utilisées pour la qpcr... 52 - ABBREVIATIONS - * p 0,05 ** p 0,01 *** p 0,001 AHR Aryl Hydrocarbon Receptor ALS Agglutinin like sequence ANOVA One Way Analysis Of Variance BCP Bromo-cresol Purple agar C12 HSL Homo-sérine lactone à 12 atomes de carbone C8 HSL Homo-sérine lactone à 8 atomes de carbone CCL20 chemokine ligand 20 CCR6 chemokine receptor 6 CFU Unité formant colonie CLR C-type lectin receptor CT Cycle seuil ELISA Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay HSL Homo-sérine lactone HWP1 Hyphal Wall Protein 1 IN Intra-Nasal IP Intra-péritonéal LB Milieu de Luria-Bertani LBA Lavage broncho-alvéolaire LPS LipoPolySaccharide MOI Multiplicity of infection MyD88 Myeloid Differenciation primary response gene 88 NFκB Nuclear Factor κ B NLR NOD-like receptor NOD Nucleotide Oligomerization Domain NS Non Significatif PAMP Motifs moléculaires associés aux pathogènes PAVM Pneumopathie acquise sous ventilation mécanique PBS Phosphate-buffered saline PNN Polynucléaires neutrophiles PQS Pseudomonas Quinolone Signal PRR Récepteur de reconnaissance des motifs QS Quorum Sensing SAP Secreted Aspartyl protease SSI Sérum salé isotonique: NaCl 9 SST Système de sécrétion de type SYK Spleen tyrosine Kinase TIRAP Toll-interleukin 1 receptor (TIR) domain containing adaptor protein TLR Toll-like receptor YPD Milieu Yeast-Peptone-Dextrose INTRODUCTION INTRODUCTION Pseudomonas aeruginosa (P. aeruginosa) et Candida albicans (C. albicans) sont des pathogènes opportunistes fréquemment isolés chez des patients présentant des facteurs de risque d infection. La résistance de P. aeruginosa aux antibiotiques est en croissance permanente et les rapports de cas de multi résistance voire de pan-résistance sont de plus en plus fréquents (1). L association de ces deux microorganismes est fréquente dans les services de réanimation, notamment au niveau des voies aériennes. L implication clinique de cette association reste indéterminée. En 2006, Azoulay et al. ont mis en évidence un association positive entre la colonisation des voies aériennes par C. albicans et le risque de pneumopathie acquise sous ventilation mécanique (PAVM) (2). Nous avons développé un modèle murin de colonisation des voies aériennes par C. albicans et avons testé l effet de cette colonisation dans notre modèle de pneumonie à P. aeruginosa. De façon surprenante, nous avons mis en évidence que la colonisation des voies aériennes par C. albicans diminuait la sévérité des pneumonies à P. aeruginosa (3). Des interactions directes ayant été mises en évidence de façon expérimentale entre P. aeruginosa et C. albicans (4,5), nous avons exploré ces interactions pour évaluer leur effet sur la protection induite par C. albicans. Mais aucune interaction directe n a permis d expliquer cette protection (Méar JB & Guery BP, travail de MASTER II, données non publiées). En revanche, l exposition des voies aériennes à C. albicans était responsable d un recrutement alvéolaire de macrophages. Nous avons par conséquent décidé d explorer la réponse immunitaire induite par C. albicans au niveau pulmonaire afin de déterminer si elle était responsable de la protection observée. L objectif de ce travail était donc d étudier la réponse immunitaire induite par C. albicans au niveau pulmonaire, pour comprendre les mécanismes diminuant la sévérité de la pneumonie à P. aeruginosa. I. La Pneumonie I. A. Définition, symptomatologie, épidémiologie La pneumonie ou infection respiratoire basse est une infection des voies aériennes inférieures. Elle résulte de la multiplication d un microorganisme (virus, bactérie ou champignon) dans un lieu habituellement exempt de pathogènes: les bronchioles et alvéoles. Les symptômes de la pneumonie associent des signes généraux (fièvre, asthénie), une toux, souvent productive, une douleur thoracique et un essoufflement. L examen clinique met en évidence des crépitants, témoins de l œdème alvéolaire lésionnel et des signes en rapport avec la tolérance de la pneumonie (augmentation de la fréquence respiratoire, cyanose, voire détresse respiratoire aiguë). La pneumonie est la quatrième cause de mortalité dans le monde et
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