Caractéristiques phénotypiques des Bacillus cereus émétiques

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Université catholique de Louvain Faculté d ingénierie biologique, agronomique et environnementale Caractéristiques phénotypiques des Bacillus cereus émétiques Elise N guessan Thèse présentée en vue de l obtention du grade de Docteur en Sciences Agronomiques et Ingénierie Biologique Président Promoteur Lecteurs Prof. Pierre Defourny Prof. Jacques Mahillon Prof. Michel Ghislain Prof. Marianne Sindic Dr. Katelijne Dierick Dr. Marie-Laure De Buyser Année académique Louvain-la-Neuve i A ma famille Remerciements À la clôture de cette thèse, je voudrais adresser un mot de remerciements à tous ceux et toutes celles qui de près ou de loin m ont aidé dans la réalisation de ce travail. Merci au Professeur Jacques Mahillon qui malgré son agenda extrêmement chargé, a toujours été disponible pour des réunions et des conseils précieux. Son implication particulière, ainsi que ses conseils instructifs et pédagogiques m ont permis de mener à bien ce travail. Merci aux Docteurs Katelijne Dierick et Marie-Laure De Buyser, aux Professeurs Marianne Sindic, Michel Ghislain et Pierre Defourny, d avoir pris de leur temps à parcourir ce travail et d avoir accepté de l évaluer en tant que membres du Jury. Merci au Professeur Mireille Dosso, grâce à qui l isolement de mes souches émétiques a été possible en CI. Merci également à Annette Kreuwels pour sa disponibilité ainsi que pour son soutien exceptionnel. Merci à Marleen Abdel Massih et à Pauline Modrie pour leurs soutiens et encouragements ainsi que leur accueil chaleureux durant ces années. Quant à Sophie Timmery et à François Louesse, je leur dis merci pour leur collaboration assidue. Que dire à Sophie Hardenne, Abir et à Valentine pour leur disponibilité et leur coup de main précieux lors du séquençage de ma souche? Soyez infiniment remerciées. Merci aussi à Laurence Delbrassinne qui a su trouver le temps de relire une partie de ce travail. Je voudrais également dire merci à Géraldine, à Daniel, à Nadine, à Elise, à Carole, à Virginie, à Sandy, à Olivier, à Annika, à Florence pour avoir tous participé de près ou de loin à la réussite de cette thèse. Jamais je ne refermerai cette liste de remerciements sans m adresser à mon Frère et sincère Ami, Dr Edouard Kouakou, qui bien qu étant à des milliers de kilomètres d ici, n a cessé de m apporter son soutien, ses conseils et ses encouragements. Enfin, Je dis merci à ma fille adorée Eva dont le sourire radieux m a permis de surmonter plusieurs difficultés, à mes parents pour leur soutien tout au long de ces années d études, à Alabi Taofic, Lucie Kablan ainsi qu à tous mes amis, pour avoir contribué à ces merveilleuses années. MERCI à TOUS! ii Résumé Bacillus cereus est un pathogène alimentaire, responsable de deux types de syndromes d intoxication. La forme diarrhéique, au travers de la production d entérotoxines et la forme émétique, via la production de la toxine émétique, le céréulide. B. cereus peut être isolé à partir de plusieurs types d aliments. Cependant, les données épidémiologiques montrent que le syndrome émétique est généralement associé à la consommation d aliments farineux tels que le riz et les pâtes. Afin de mieux comprendre pourquoi d autres denrées telles que les légumes, les salades ou même le lait ne sont pas associés à ce type d intoxication, différents aliments ont été analysés en vue d isoler et de caractériser des B. cereus émétiques. Sur 393 échantillons d aliments investigués, 409 souches de B. cereus ont été isolées et six souches émétiques ont été identifiées. La moitié des souches émétiques a été isolée à partir d aliments, n étant généralement pas impliqués dans les intoxications émétiques. Les B. cereus isolés ont été inclus dans une étude de distribution et de diversité réalisée sur une collection de 2,000 souches provenant de diverses origines. Cette étude a mis en évidence une importante diversité au sein des souches émétiques. Afin d étudier en détail cette diversité, plus de 70 propriétés métaboliques d une collection de 33 souches émétiques ont été analysées. Plusieurs différences phénotypiques ont été mises en évidence. Dans la plupart des intoxications alimentaires émétiques, les tests microbiologiques effectués révèlent un nombre important de souches émétiques. Afin de mieux comprendre le comportement de ces dernières vis-à-vis d autres B. cereus non émétiques, une souche iii émétique mutante spontanée, résistante à l antibiotique rifampicine a été utilisée comme inoculum. L objectif étant d imiter la réalité des intoxications émétiques, des échantillons de riz ont été utilisés comme matrices alimentaires. Une forte croissance de la souche émétique mutante a été observée 24 heures après inoculation, atteignant des taux de unités formant colonies par gramme de riz. La toxine émétique a également été détectée dans le riz par la chromatographie liquide associée à la spectrométrie de masse. iv Table des matières Chapitre 1. Introduction... 1 I.1 Le groupe Bacillus cereus... 3 I.1.1 Bacillus thuringiensis... 6 I.1.2 Bacillus anthracis... 8 I.1.3 Bacillus mycoides et Bacillus pseudomycoides I.1.4 Bacillus weihenstephanensis I.2 Bacillus cereus sensu stricto I.2.1 Ecologie de Bacillus cereus sensu stricto I Réservoirs primaires I Bacillus cereus dans les aliments I.2.2 Toxi-infection et intoxications alimentaires liées à Bacillus cereus I Le syndrome diarrhéique I Le syndrome émétique I Enumération de Bacillus cereus dans les aliments I.3 Toxines de Bacillus cereus I.3.1 Toxines diarrhéiques I.3.2 Toxine émétique I Historique de la toxine émétique I Structure du céréulide : la toxine émétique I Diversité des souches émétiques v I Méthode de détection et de quantification du cereulide.. 29 I.4 Régulation des facteurs de virulence chez Bacillus cereus I.4.1 Les régulons PlcR et NprR I.4.2 Régulation de l expression du céréulide I Régulation génétique I Facteurs affectant la production du céréulide Chapitre 2. Objectifs de l étude Chapitre 3. Résultats Distribution et diversité des souches émétiques Diversité phénotypique des souches de Bacillus cereus émétiques Comportement d une souche émétique de Bacillus cereus dans le riz Chapitre 4. Discussion générale Souches émétiques et sécurité alimentaires Diversité phénotypique des souches émétiques Comportement d une souche émétique de Bacillus cereus dans le riz Chapitre 5. Conclusions et perspectives Chapitre 6. Références vi Liste des abréviations AFSCA BCET BHI CcpA Ces CFU Cry cspa Cyt K EFSA HBL ISO ISP k5975cr LacI/GalR LB LC-MS MLST MYP NHE NprA NprR NRPS PBW PCR PFGE PlcR PrgX Rap RAPD s.l. s.s. agence fédérale pour la sécurité de la chaîne alimentaire enterotoxines de Bacillus cereus brain heart infusion catabolite control protein A cereulide colony forming unit gène de l endotoxine cristalline cold-shock protein A cytotoxine K european food safety authority hemolysine BL international organization for standardization institut de santé publique Kinrooi 5975 c rifampicin-résistant lactose repressor/galactose repressor protein Luria Bertani liquid chromatography-ion trap mass spectrometry multi locus sequence typing mannitol-egg yolk-polymixin non-hemolytic enterotoxin neutral protease A neutral protease R non-ribosomal peptide synthetase peptone buffer water polymerase chain reaction pulsed-field gel electrophoresis phospholipase C regulator sex pheromone receptor regulator aspartyl-phosphate random amplified polymorphic DNA sensu lato sensu stricto vii Chapitre 1: Introduction Chapitre 1 : Introduction Les spores de B. cereus sont ubiquistes et peuvent contaminer les aliments via les matières premières. Elles sont capables de résister aux traitements thermiques ainsi qu à d autres procédures telles que la déshydratation, la dessiccation, la désinfection et autres facteurs environnementaux, qui empêchent le développement d autres bactéries capables de rentrer en compétition avec elles. Ce pathogène alimentaire peut ainsi causer de sérieux problèmes tels que le changement de texture et le développement de saveurs indésirables dans l industrie alimentaire. Aussi, compte tenu de sa psychrotolérance, cette bactérie constitue un potentiel pathogène émergent des produits réfrigérés prêts à la consommation (Rajkovic et al., 2006a; Bartoszwicz et al., 2008). B. cereus demeure une cause importante d intoxications alimentaires dans le monde (Schmidt, 2001). Cependant, le nombre d intoxications qui lui sont liées est généralement sous-estimé, étant donné que leur déclaration n est pas obligatoire (El-Banna, A.A., 2009). Les deux principaux types de syndromes diarrhéique et émétique provoqués par B. cereus sont généralement bénins, cependant certains cas graves et même mortels ont été rapportés ces dernières années (Malher et al., 1997; Lund et al., 2000; Dierick et al., 2005; Posfay-Barbe et al., 2008; Shiota et al., 2010). En Belgique, deux cas d intoxications émétiques ont été signalés (M. Naranjo and colleagues, com. Pers., 2009; Dierick et al., 2005). Ils concernaient une fillette de 7 ans et un jeune homme d une vingtaine d années, tous deux décédés après avoir consommé des plats de pâtes contenant un nombre important de B. cereus émétiques. Plusieurs 1 Chapitre 1: Introduction travaux ont établi un lien direct entre les intoxications émétiques et la consommation de produits alimentaires farineux, alors que B. cereus est très répandu dans la nature. Il est évident qu une meilleure connaissance de ces souches émétiques s avère nécessaire afin de mieux comprendre leur mode de fonctionnement. Cela pourrait contribuer à un développement futur de méthodes permettant de détecter facilement les souches émétiques et de réduire potentiellement les intoxications alimentaires qui leur sont attribuées. 2 Chapitre 1: Introduction I. 1 Le groupe B. cereus Le groupe B. cereus comprend six espèces de bactéries Grampositives formant des endospores et qui sont génétiquement très proches. Ces espèces, regroupées sous le nom de Bacillus cereus sensu lato sont : B. cereus sensu stricto, un pathogène opportuniste pour les humains ainsi que les animaux ; Bacillus anthracis, responsable de l anthrax également chez les humains et les animaux ; Bacillus thuringiensis, un pathogène des insectes ; Bacillus weihenstephanensis qui est psychrotolérant ; Bacillus mycoides et Bacillus pseudomycoides, des espèces non pathogènes et qui se distinguent des autres membres du groupe par l aspect particulier de leurs colonies rhizoïdes sur milieu nutritif solide. La distinction entre ces deux espèces est basée sur leur composition en acide gras. Les membres de ce groupe appartiennent à la famille des Bacillaceae. Ce sont, pour la plupart des anaérobies facultatives, mobiles par flagelles péritriche ou immobiles. Malgré leur proximité génétique, les relations phylogénétiques et taxonomiques précises des membres du groupe B. cereus, restent encore controversées (Helgason et al., 2004). La classification des bactéries de ce groupe était initialement basée sur des caractères phénotypiques tels que la formation d inclusions cristallines parasporales composées de protéines insecticides chez B. thuringiensis et la présence de capsule chez B. anthracis. Cependant, malgré ces différences phénotypiques, la comparaison des séquences nucléotidiques de leurs ARN ribosomaux 16S a montré moins de 1 % de divergence (Ash et al., 1991). Selon plusieurs études, B. cereus s.s., B. anthracis, et B. thuringiensis pourraient être considérés comme appartenant à une même espèce. En effet, les principales différences 3 Chapitre 1: Introduction entres ces espèces sont basées sur leurs facteurs de virulences, codés par des gènes qui sont portés par des plasmides. En outre, certains de ces plasmides peuvent être échangés entre les membres du groupe B. cereus (Thomas et al., 2000 ; Van Der Auwera et al., 2007). Par conséquent, si une souche de B. thuringiensis perd ses plasmides, elle devient indiscernable de B. cereus sensu stricto. Plusieurs méthodes d analyses décrites dans la littérature visent à distinguer les membres du groupe B. cereus : MLEE (MultiLocus Enzyme Electrophoresis) (Carlson et al., 1994; Helgason et al., 1998; Helgason et al., 2000), AFLP (Amplified Fragment Length Polymorphism) (Hill et al., 2004; Keim et al., 1997; Ticknor et al., 2001), rep-pcr (Cherif et al., 2003; Kim et al., 2001; Reyes-Ramirez & Ibarra, 2005) et MLST (MultiLocus Sequence Typing) (Helgason et al., 2004; Sorokin et al., 2006). Cependant, aucune de ces études ne permet de séparer clairement ces espèces. Néanmoins, la pathogénicité de B. anthracis et l utilisation de B. thuringiensis comme agent de lutte biologique en agriculture ont pris le dessus sur les considérations taxonomiques. Ces espèces sont par conséquent toujours considérées comme séparées. Une division du groupe B. cereus sensu lato en sept grand groupes phylogéniques (I- VII), basés sur des critères génétiques et phénotypiques a été proposée récemment (Table 1) (Guinebretière et al., 2008). Selon cette classification, chaque groupe correspond à un «thermotype» particulier qui montre clairement la différence entre les capacités à se développer à basses ou hautes températures. Aussi, des capacités de virulence peuvent être associées à chaque groupe. Les bactéries du groupe VII dans cette nouvelle classification, qui se développent à haute température constituent une nouvelle espèce appelée «B. cytotoxicus» (Carlin et al., 2009). 4 Tableau 1. Les sept groupes de B. cereus (Guinebretière et al., 2008) Groupes Espèces Espèces Association à des toxi-infections alimentaires Températures ( C) de croissance Résistance des spores a Observations b I B. pseudomycoides Non nd Mésophiles ; colonies rhizoïdes sur agar II B. cereus II, B. thuringiensis II Oui La plupart des souches sont psychrotolérantes. Le variant psychrotolérant du gène cspa est absent III IV V Souches émétiques B. cereus III, B. thuringiensis III B. anthracis B. cereus IV, B. thuringiensis IV B. cereus V, B. thuringiensis V Oui Mésophile Oui Mésophile Oui Mésophile VI B. weihenstephanensis B. mycoides B. thuringiensis VI Non Toutes les souches sont psychrotolérantes. Le variant psychrotolérant du gène cspa est présent VII B. cytotoxicus Oui Thermotolérant; très peu de souches de ce groupe ont été trouvées, mais très souvent associées à des toxi-infections alimentaires nd, non déterminé a Classement établit par Afchain et al. (2008); Carlin et al. (2006, 2009). b CspA : Major Cold Shock Protein A Chapitre 1: Introduction I.1.1 B. thuringiensis B. thuringiensis est une bactérie ubiquiste, d origines diverses telles que le sol, les insectes, les excréments d animaux végétariens, les produits végétaux entreposés ainsi que les habitats aquatiques (Martin and Travers, 1989). L énorme succès biotechnologique de ce pathogène réside dans sa capacité à produire des inclusions cristallines protéiques (δ-endotoxines) nommées «protéine Cry», au cours de la sporulation. Les δ-endotoxines, utilisées comme pesticides biologiques ont un large spectre d action spécifique contre plusieurs groupes d insectes : Lépidoptères, Diptères, Coléoptères, certains Nématodes et aussi les Protozoaires (Feitelson et al., 1992 ; Sauka and Benintende, 2008). Trois applications principales des protéines Cry ont été rapportées. Il s agit du contrôle des ravageurs de cultures, du contrôle des moustiques qui véhiculent des maladies humaines et du développement des plantes résistantes aux insectes transgéniques (Bravo et al., 2007). Les protéines Cry sont codées par les gènes cry, localisés sur des grands plasmides, de 50 à 350 kb en taille (Gonzalez et al., 1982 ; Höfte and Whiteley, 1989) et très rarement sur des chromosomes (Kronsdad et al., 1983). B. thuringiensis possède des similarités phénotypiques avec B. cereus s.s., incluant la mobilité, l activité hémolytique, la résistance à l ampicilline. Comme indiqué précédemment, la seule caractéristique qui permet de différencier ces deux espèces est la présence d inclusions cristallines protéiques chez B. thuringiensis. Selon plusieurs études, le transfert par conjugaison des gènes qui codent pour ces inclusions cristallines est plus fréquent chez les insectes que dans le sol stérilisé. (Vilas-Boas et al., 2000). A ce 6 Chapitre 1: Introduction jour, plus de 400 gènes cry ont été séquencés et classés en 51 groupes différents en fonction de la similarité (Vilas-Boas et al., 2007). Les protéines Cry appartiennent à la classe des toxines bactériennes «PFT» (Pore-Forming Toxin). En plus de la toxine Cry, cette classe contient d autres toxines bactériennes telles que la colicine A de Pseudomonas, ou encore la toxine diphtérique (Parker and Feil, 2005). Le mode d action des protéines cristallines comprend plusieurs étapes qui conduisent à la lyse de la cellule hôte. Après ingestion, les cristaux protéiques sont solubilisés dans l environnement alcalin de l intestin des insectes sensibles. Les pro-toxines Cry libérées sont ensuite activées par les protéases intestinales. Ces formes actives des toxines vont se fixer spécifiquement sur des récepteurs de l épithélium intestinal, s insérer dans la membrane et créer des pores provoquant la fuite du contenu de la cellule, ce qui conduit à la mort des cellules intestinales et bien évidemment à la mort de la larve (Schnepf et al., 1998 ; Bravo et al., 2007). La spécificité et l innocuité de ces δ-endotoxines vis-à-vis des végétaux, des animaux et de la faune entomologique non cible (abeilles, coccinelles) justifient, l utilisation depuis plusieurs années de B. thuringiensis comme insecticide à l échelle industrielle. En plus d être introduits dans des microorganismes tels que Escherichia coli, plusieurs gènes cry sont utilisés dans les plantes telles que le tabac, le riz, le coton ou le maïs. Ces plantes transgéniques appelées «plantes Bt», ciblent certains ravageurs (Lépidoptères, Coléoptères) (Shelton et al., 2002). Leur culture a non seulement des effets économiques positifs pour les producteurs mais permet aussi une réduction de l utilisation des insecticides chimiques néfastes pour l environnement. Cependant, parce qu elles exposent les larves en 7 Chapitre 1: Introduction permanence à l insecticide, les plantes transgéniques favorisent et accélèrent le développement de résistances chez les insectes. Des stratégies sont donc développées pour diminuer ou retarder l apparition de ces populations d insectes (Gould, 1998 ; Bourguet, 2004). Certaines souches de B. thuringiensis produisent d autres protéines ayant une activité insecticide en plus des toxines Cry. Parmi elles, les cytotoxines (Cyt) qui contrairement aux toxines Cry ne sont pas spécifiques des insectes mais sont hémolytiques et cytolytiques contres les cellules de mammifères. Compte tenu de la similarité taxonomique de B. thuringiensis et de B. cereus, ainsi que l introduction de plusieurs souches de B. thuringiensis dans les aliments via les insecticides à base de ce pathogène, il est raisonnable de penser que certaines infections alimentaires généralement attribuées à B. cereus, auraient pu être causées par B. thuringiensis (Rosenquist et al., 2005). Des toxiinfections occasionnelles impliquant B. thuringiensis ont par ailleurs été rapportées (Jackson et al., 1995). I.1.2 B. anthracis B. anthracis se distingue des autres membres du groupe B. cereus par son absence de mobilité, sa production de capsule, sa sensibilité à la pénicilline et son absence d activité hémolytique (Vilas-Boas et al., 2007). Les spores de B. anthracis sont très résistantes aux conditions environnementales défavorables et sont capables de survivre dans les sols contaminés pendant de longues périodes (Mock and Fouet, 2001). Ce pathogène est responsable de l anthrax, la maladie du 8 Chapitre 1: Introduction charbon qui affecte les animaux, particulièrement les herbivores mais aussi les humains. La maladie se présente sous trois formes distinctes : pulmonaire, gastro-intestinale et cutanée. La forme pulmonaire contractée par inhalation est
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